Modelagem molecular

A modelagem molecular é uma área dentro da física e da química que representa a estrutura da matéria em nível molecular. Esta área é capaz de criar modelos que podem agrupar, prever e desenvolver novos materiais. Porém, como estes sistemas são complexos, as contradições se sobrepõem às correlações.

Ela estuda as origens moleculares da atividade biológica dos fármacos, relacionando estrutura e atividade e aplicando os fundamentos no planejamento racional dos fármacos. As teorias explicando a atividade farmacológica sustentam-se no paradigma "chave-fechadura", onde as "fechaduras" (receptores celulares) são biomacromoléculas extremamente sensíveis responsáveis pelo reconhecimento molecular de espécies endógenas e exógenas com atividade biológica. Eles interagem reversivelmente com moléculas bioativas, consideradas como as "chaves”.

No nível experimental, o conhecimento da estrutura da molécula não é tarefa simples. São poucos os métodos capazes de caracterizar completamente certa estrutura, permitindo sua descrição com precisão. A cristalografia ainda é a técnica mais eficiente, porém é limitada à substâncias em fase cristalina (não há garantia das moléculas terem conformação idêntica a moléculas em solução. Neste conceito houve o surgimento dos métodos computacionais como uma alternativa.

A ação das moléculas bioativas é bastante complexa, tendo seus efeitos associados a interações ou reações químicas com estruturas macromoleculares presentes no sistema vivo (proteínas, na grande maioria). Se estas proteínas forem receptores, as moléculas são classificadas como agonistas ou antagonistas de receptores. No caso das enzimas, estas moléculas atuam como inibidores enzimáticos. Interações intermoleculares, que podem ser determinantes da ação da molécula bioativa ou ser complementadas por reações com aminoácidos da proteína-alvo, são fundamentais para que a molécula tenha seu efeito biológico ou farmacológico.

O uso da química computacional vem desde a década de 60. Em 1972, o uso de computadores na educação química já era foco de pesquisas. Anos mais tarde, no University Chemical Laboratory de Cambridge, no Reino Unido, usavam microcomputadores como ferramenta de ensino para a Teoria do Orbital Molecular. Dez anos depois, Real Academia de ciências da Suécia outorgou o Prêmio Nobel de Química de 1998 aos pesquisadores Walter Kohn e John A. Pople. A IUPAC define a química computacional como: "aspectos da pesquisa molecular que são tornados práticos pelo uso de computadores".

A primeira representação de moléculas através de fórmulas estruturais, realizada por Van't Hoff e Le Bel, ocorreu em 1874 com a descoberta do arranjo tetraédrico dos átomos de carbono em compostos orgânicos. Já em 1953, Barton introduziu o conceito de análise conformacional, estabelecendo que moléculas podem ser representadas por arranjos atômicos espaciais diferentes. Na segunda metade da década de 50 houve o desenvolvimento da cristalografia de raios X. A elucidação das estruturas tridimensionais permitiu a obtenção de parâmetros estruturais, além da definição de propriedades atômicas. Desta forma, houve a possibilidade de representação tridimensional de moléculas em escalas relativamente reais.

Três diferentes modelos de representação da estrutura do propano, desenvolvidas entre 1959-1965

Fonte: SANTOS, H. F.; Cadernos temáticos de química nova na escola, 2001

Através da química computacional, há a capacidade de visualizar eventos que acontecem a nível microscópico ajudando na descrição, explicação e exploração dos fenômenos e ideias abstratas. Podem ser encontradas ferramentas que simulam conceitos e fatos que possuem relação com esses sistemas. Não é fácil a criação de uma ferramenta computacional que produza simulações, além de não ser econômico. O programa se comporta como um laboratório virtual, permitindo a visualização dos acontecimentos quando o sistema é aquecido ou resfriado, quando sofre um aumento ou diminuição da densidade e quando há aumento ou diminuição da pressão ambiente.

O uso de métodos computacionais têm se tornado uma prática rotineira. Do ponto de vista do planejamento, deve-se destacar que não se pretende chegar a uma molécula bioativa simplesmente pelo uso de programas de computador. O desenvolvimento de moléculas com essa complexidade requer o trabalho de uma equipe multidisciplinar, que fará uso métodos computacionais de modo sistemático com intenção de facilitar e otimizar o processo de desenvolvimento de compostos bioativos, em constante troca de informações com grupos de síntese química e avaliação de atividades dos compostos.

Na química computacional destaca-se o "docking" molecular, ou docagem molecular ou simplesmente ancoramento, introduzida na década de 80. Investiga as possíveis orientações que a molécula assume no interior do sítio ligante, sendo usado na triagem virtual. É um dos principais métodos de SBDD (técnica baseada no conhecimento do arranjo topológico de alvos moleculares, utiliza como pré-requisito a informação 3D detalhada da molécula em estudo). Este método envolve uma função de energia que contêm parâmetros eletrostáticos, que geram modelos matemáticos que predizem as orientações e conformações mais estáveis que um ligante adota no receptor. As mais recentes versão de programas em docagem (FlexE e GOLD) consideram a flexibilidade do ligante e as cadeias laterais do receptor, enquanto os métodos mais recentes (FlexX-Pharm e GLUE) utilizam informações farmacofóricas do receptor para guiar as simulações.

O processo de docagem pode ser dividido em modelagem do modo de ligação (considerada a etapa mais simples e robusta) e predição da afinidade do ligante pelo sítio. Para a realização da primeira etapa, são utilizados diferentes métodos de amostragem que irão atribuir flexibilidade à molécula do ligante. Os métodos de amostragem podem ser classificados em: métodos sistemáticos, métodos aleatórios ou estocásticos e métodos de simulação. A etapa de predição é realizada baseada em funções de pontuação desenvolvidas para avaliação e classificação do modo de interação proposto na etapa de modelagem do modo de ligação. As funções de pontuação podem ser agrupadas em: campos de força, empíricas e funções baseadas no conhecimento.

Etapas envolvidas no processo de docagem molecular

Dentre as funções citadas anteriormente, a categoria dos campos de força tem sua base em métodos de mecânica molecular, além de quantificar a energia gerada pelas interações entre o ligante e o receptor e a energia interna do ligante (G-score e D-score, implementados no pacote de programas SYBYL; Amber, implementado no programa AUTODOCK; GOLDscore implementado o programa GOLD). A categoria empírica é fundamentada no ajuste teórico de dados experimentais através do uso de equações (regressão linear, LigScore, PLP, LUDI, F-Score, ChemScore e X-score). Por fim, a categoria das funções baseadas no conhecimento utiliza dados estatísticos dos potenciais de pares atômicos de interação, que são derivados de conjuntos de dados vindos de complexos cristalográficos entre proteínas e ligantes (PMF e DrugScore).

O planejamento de moléculas baseado em estrutura e no mecanismo de ação é uma das estratégias mais usadas, contribuindo em todos os estágios do processo. Informações estruturais permitem a descoberta, seleção e síntese de compostos complexos, que se tornam mais atrativos quando utilizados com proteínas, afinal 78% dos fármacos recentes têm como alvo terapêutico esse tipo de molécula.

As aproximações mais usadas em modelagem molecular são a aproximação clássica e a aproximação quântica. A primeira inclui os métodos da mecânica molecular e da dinâmica molecular, enquanto a segunda inclui os métodos ab initio e semi-empíricos. A escolher destas aproximações depende das propriedades a serem avaliadas, da precisão desejada e da capacidade computacional que estará disponível para realizar os cálculos.

Modelagem molecular

Fonte: CAMPOS, A. F. C.; Introdução à modelagem molecular, 2013

Na mecânica molecular, as moléculas são descritas como um conjunto de "átomos conectados". Seu modelo é justificável pelos parâmetros associados a conjuntos de átomos permanecerem razoavelmente constantes entre estruturas diferentes, desde que do mesmo tipo e com a mesma hibridação. O que se faz nesse modelo é desenvolver o campo de força, conjunto de funções de energia que determinam penalidades energéticas para o afastamento da estrutura dos valores "normais". A metodologia da mecânica molecular é baseada na aproximação de Born-Oppenheimer, conhecida como superfície de energia potencial, onde os movimentos dos núcleos e dos elétrons podem ser tratados separadamente. Supostamente, a densidade eletrônica pode ajustar-se instantaneamente a qualquer alteração na configuração geométrica dos núcleos.

Não há regras a respeito do número ou tipo de função de energia potencial a serem usados. Dependendo da função, são permitidos: cálculos das propriedades geométricas; cálculos das propriedades geométricas e vibracionais; cálculos das propriedades geométricas e termodinâmicas; cálculos das propriedades geométricas, vibracionais e termodinâmicas. As expressões da energia potencial para cálculos de mecânica são descendentes de três tipos básicos de campo de força: campo de força central (considera apenas distâncias interatômicas), campo de força de valência geral (considera comprimentos e ângulos de ligação, ângulos diedros, coordenadas de deformação fora do plano e adicionam os termos cruzados) e campo de força de Urey-Bradley (considera comprimentos e ângulos de ligação, ângulos diedros, coordenadas de deformação fora do plano e as interações entre átomos ligados por um centro comum).

A dinâmica molecular é uma das técnicas computacionais mais versáteis para o estudo de macromoléculas biológicas. Este método tem contribuído em diversos estágios do processo de planejamento de fármacos. É fundamentada na mecânica clássica e fornece informações sobre o comportamento dinâmico microscópico. Baseada na mecânica molecular, as moléculas são tratadas como uma coleção de átomos que podem ser descritas por forças newtonianas (mantidas unidas por forças harmônicas ou elásticas).

Entre diversos métodos computacionais que simulam materiais, destacam-se os que não usam informações empíricas, ou seja, não utilizam informações vindas de medidas experimentais sobre o sistema a ser estudado. Estes métodos são conhecidos por métodos de primeiros princípios ou métodos "ab initio" devido sua capacidade de resolução de problemas quânticos de átomos interagentes, além de providenciar a descrição do sistema eletrônico e nuclear do material. O método de Hartree-Fock (HF) foi primeiro métodos deste tipo, ainda sendo usado atualmente na simulação de moléculas, clusters atômicos e outros sistemas quânticos de menor porte. Nos anos 70 do século passado foram criados métodos baseados na Teoria Funcional da Densidade (DFT), focada no cálculo das propriedades microscópicas dos sólidos: LAPW (Linearized Augmented Plane Wave), LMTO (Linear Muffin Tin Orbital). Como eram utilizados praticamente apenas códigos de computadores, inicialmente suas aplicações eram limitadas, porém com a evolução tecnológica, estes métodos atingiram um alto grau de eficiência, permitindo o seu uso para simular sistemas reais, encontrados na natureza ou produzidos laboratorialmente. Existem programas gratuitos, como o GAMESS, que permitem a realização dos cálculos ab initio.

Depois de trabalhos pioneiros de Pople e colaboradores, Dewar e colaboradores criaram programas para tornar acessível os cálculos semi-empíricos de orbitais moleculares aos não especialistas. Estes programas deveriam oferecer informações estruturais quimicamente preciisas com um custo razoável de tempo de cálculo. Os métodos semi-empíricos de maior uso são o AM1 (Austin Model 1 ou Modelo Austin 1) e o PM3 (Parametric Method 3 ou Métodos Paramétrico 3), que incorporam aproximações semelhantes, no entanto, possuem parametrizações diferentes. Estes métodos possuem aplicação limitada aos elementos para os quais foram desenvolvidos parêmetros correspondentes: no método AM1 são os elementos H, Na, K, Rb, Zn, Hg, B, Al, C, Si, Ge, Sn, N, P, O, S, F, Cl, Br e I, enquanto o métodos PM3 conta com os mesmos elementos (exceto o B) e elementos que não estão no AM1: Be, Mg, Cd, Ga, In, Tl, As, Sb, Bi, Se e Te. Os métodos semi-empíricos foram para reprodução de série de dados experimentais, como geometrias de equilíbrio, calores de formação, momenos de dipolo e energias de ionização. Eles estão presentes em programas públicos, como o programa de cálculo de orbitais moleculares MOPAC. Atualmente foram apresentadas duas novas parametrizações: o modelo RM1 (Recife Model 1) e o PM6 (Parametric Method 6), que disponibilizam parâmetros para 70 elementos da tabela periódica.

A Teoria do Funcional Densidade (TFD) (DFT - Density Functional Theory) surgiu como alternativa para os métodos tradicionais, ab initio e semi-empíricos, no que diz respeito ao estudo de propriedades do estado fundamental de sistemas moleculares. Sua grande vantagem em relação aos outros métodos está no ganho em velocidade computacional e espaço em memória. Como nas derivações das equações nenhum parâmetro em princípio precisa ser ajustado ou determinado empiricamente, a TFD pode ser considerada como uma teoria da natureza ab initio, sendo útil no estudo de grandes sistemas moleculares e descrevendo realisticamente sistemas orgânicos, inorgânicos, metálicos e semi-condutores. Desta forma, a metodologia do funcional de densidade vem sendo usada cada vez mais para sistemas moleculares encontrados em pesquisas farmacêuticas, agroquímicas e biotecnológicas; na ciência de materiais e polímeros; em pesquisas com complexos organometálicos e aglomerados típicos em catálise, superfície e estado sólido; em eletroquímica e microeletrônica, sistemas estes fora do alcance de métodos de natureza ab initio padrões. Atualmente tem-se usado o modelo do funcional de troca híbrido de 3 parâmetros de Becke e do funcional de correlação de Lee-Yang-Parr (B3LYP), por causa da qualidade dos seus resultados, principalmente para moléculas orgânicas.

Os métodos de análise populacional fazem a partição da densidade eletrônica (DE) entre os átomos de um sistema. A DE define qual fração dos elétrons permanece nos átomos após o estabelecimento das ligações químicas da estrutura molecular. Há métodos alternativos para calcular a DE, que levam a resultados que concordam qualitativamente, como na aproximação LCAO, que são as análises populacionais de Mulliken e de Löwdin. A análise populacional de Mulliken é o método mais tradicional e mais usado entre os químicos. Esse método é baseado na teoria dos orbitais moleculares, onde um conjunto de orbitais é definido por uma combinação linear de orbitais atômicos, também conhecidos como funções de base, cujos coeficientes são determinados pelo métodos de Hartee-Fock.

A análise populacional de Mulliken deve sua popularidade à intensiva aplicação dos métodos que empregam a teoria dos orbitais moleculares e à facilidade com que pode ser calculada, além de obter as variáveis usadas para efetuar a análise populacional diretamente, não necessitando nenhum custo adicional. No entanto, este método possui limitações importantes. Uma fonte de problemas é a divisão das populações de recobrimento em contribuições atômicas e a consequências desta falha é a péssima reprodução do momento dipolar molecular calculado através da função de onda SCF utilizando as cargas de Mulliken. Outro problema é a forte dependência do conjunto de base empregado no cálculo, consequente desta função ser projetada diretamente sobre as funções de base utilizadas. Em diversos casos a análise oferece resultados razoáveis, porém em outros ela não é satisfatória devido às limitações descritas. Tentando reduzir estes problemas, diversas modificações foram propostas, no entanto, sem sucesso significativo. O método com mais popularidade foi o de Weinhold e Reed, que tinha finalidade de minimizar os problemas usando um procedimento mais complexo de partição da densidade eletrônica.

Os métodos de modelagem por comparação com estruturas conhecidas têm importante aplicação no estudo de bioativos. São utilizados bancos de dados de estruturas de alças de proteínas, nos quais pode-se procurar estruturas que tenham as conformações energética e geometricamente mais favoráveis. É o caso da modelagem de proteínas por homologia, onde muitas vezes somente a sequência primária de um receptor ou de uma enzima é conhecida. É usado um algoritmo de reconhecimento de moldes adequados em um banco de dados de estruturas tridimensionais de proteínas, que depende do reconhecimento da similaridade entre as estruturas. Com base em um ou mais moldes, os resíduos de aminácidos da proteína são montados para se criar um modelo primário, que depois é otimizado por um método de mecânica molecular. Quanto maior o número de resíduos idênticos entre o molde e o modelo, melhor a qualidade do modelo final. Pode ser feito em sites como o servidor Swiss-Model ou em programas específicos. Em alguns casos as limitações inerentes aos métodos comparativos podem ser reduzidas aplicando-se de métodos híbridos.

A modelagem de proteínas por homologia possui basicamente quatro passos: identificação e seleção de proteínas-molde, alinhamento das sequências de resíduos, construção das coordenadas dos modelos e validação. Para cada passo há um número de métodos, programas e servidores específicos da internet. As etapas com mais problemas são o alinhamento das sequências e a modelagem das regiões de alças. Diversos avanços foram feitos nos métodos de alinhamento de sequências, porém a modelagem de alças ainda é um fator limitante, principalmente quando há um grande número de resíduos. Os erros normalmente encontrados podem ser divididos em: erros de modelagem das cadeias laterais, deslizamento em regiões do alinhamento, erros em regiões sem molde, erros de alinhamento e moldes incorretos.

Esquema geral do processo de modelagem de proteínas por homologia

Fonte: FILHO, O. A. S.; ALENCASTRO, R. B., Modelagem de proteínas por homologia, 2003

Cromatografia

A cromatografia é uma técnica quantitativa com finalidade de identificação e separação-purificação de misturas. Usa propriedades como solubilidade, tamanho e massa. O processo de separação de mistura passa por duas fases: fase estacionária (fixa, com material poroso como filtro) e fase móvel (com um líquido ou um gás), sendo que os constituintes da mistura interagem com as fases fazendo a separação (a mistura pode ser separada em várias partes ou ser purificada).

Foi originada a partir do termo grego chroma (cor) + graphein (escrever). Começou a ter maior importância em 1903, com o botânico Mikhail Semenovich Tswett, nascido em Asti (Itália), com família de origem russa. Mikhail desenvolveu diversos trabalhos na separação de extratos de plantas durante suas pesquisas sobre a clorofila, onde foi verificada a formação de bandas de cores diferentes nas colunas utilizadas, e mais tarde foi considerado a pai da cromatografia.

Apesar deste estudo, a técnica foi ignorada até ser redescoberta na década de 30. A partir daí, trabalhos na área e os avanços tecnológicos possibilitaram o aperfeiçoamento da técnica, levando-a a um elevado grau de sofisticação.

Essa técnica tem inúmeras aplicações, como a separação de componentes relativamente voláteis (álcoois, cetonas, aldeídos e outros), além da purificação de produtos farmacêuticos, proteínas, aminoácidos, ácidos nucleicos, vitaminas e esteróides.

Há várias maneiras de se medir a área de um pico cromatográfico, dentre elas estão as técnicas manuais (ocorre a coleta do cromato por um registrador analógico, onde a área dos picos é medida manualmente, usando-se o procedimento baseado na suposição do pico cromatográfico se assemelhar a um triângulo isóscele), integradores eletrônicos (dispositivos baseados em microprocessadores que, ao coletar o sinal cromatográfico, o digitalizam, detectam a presença de picos e calculam sua área, costumando ser muito mais precisos e rápidos do que qualquer método manual) e computadores (pode ser usado no lugar do integrador, desde que este contenha um dispositivo para converter o sinal elétrico em números que possam ser armazenados em memória, além da necessidade de disposição de programas para fazer análise do cromato digitalizado).

As fases móvel e estacionária são caracterizadas da seguinte forma: fase estacionária (fase fixa, onde a substância se fica na superfície de outro material) e fase móvel (fase onde as substâncias são “arrastadas” por um solvente fluido, podendo ser líquido ou gasoso).

A fase móvel apresenta três tipos de cromatografia: a cromatografia gasosa (CG), a cromatografia líquida e a cromatografia supercrítica (CSC, onde é usado um vapor pressurizado, acima de sua temperatura crítica). A cromatografia líquida ainda é subdividida em: cromatografia líquida clássica (CLC, onde a fase móvel é arrastada através da coluna apenas pela força da gravidade), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE, onde se utilizam fases estacionárias de partículas menores, sendo necessário o uso de uma bomba de alta pressão para eluição da fase móvel). Nas fases móveis gasosas, as separações podem ser obtidas por cromatografia gasosa (CG, onde são utilizadas colunas de maior diâmetro empacotadas com a fase estacionária) e por cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR, onde são utilizadas colunas capilares nas quais a fase estacionária é um filme depositado na mesma).

Já a fase estacionária, distingue-se entre fases estacionárias sólidas, líquidas e quimicamente ligadas. Em casos de fases estacionárias líquidas, este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte sólido ou imobilizado sobre ele, enquanto em fases quimicamente ligadas, suportes modificados são considerados separadamente por diferirem dos outros em seu mecanismo de separação.

Os constituintes básicos de um sistema cromatográfico são: reservatório de gás de arraste e controles de vazão/pressão, sistema de introdução de amostra (injetor/vaporizador), coluna cromatográfica e controle de temperatura da coluna (forno da coluna), detector, eletrônica de tratamento (amplificação) de sinal e registro de sinal (registrador ou computador).

No reservatório, o gás de arraste (os mais usados são H2, He e N2) fica contido em cilindros sob pressão e com vazão constante, dessa forma o gás não depende da amostra a ser separada, além disto, seu parâmetro mais importante é sua compatibilidade com o detector. A introdução da amostra é feita no injetor, que é um bloco de metal com um orifício contendo um septo, de borracha ou silicone, onde amostras líquidas ou gasosas podem ser injetadas; o mesmo deve estar aquecido a uma temperatura acima do ponto de ebulição dos componentes da amostra (temperaturas excessivamente altas podem decompor a amostra), para que haja volatilização da amostra e a mesma seja carregada para a coluna. Depois de injetada, a amostra é colocada na coluna cromatográfica, onde é feita a separação. A afinidade de um soluto é determinada pela volatilidade do soluto, pressão do vapor e temperatura. O detector quantifica e indica o que sai da coluna. A eletrônica de tratamentos purifica os ruídos para melhor análise, enquanto o registro de sinal analisa e avalia os dados obtidos no processo.

Cromatógrafo

 Fonte: site “PG HST”

        A cromatografia gasosa (CG) é usada para fins analíticos e permite a separação de substâncias voláteis arrastadas por um gás através de uma fase estacionária, sólida ou líquida, que propicia a distribuição dos componentes da mistura entre as duas fases através de processos fisioquímicos. Na fase móvel é usado o gás de arraste (dentre os mais usados estão o hidrogênio, azoto, hélio e árgon), que transporta a amostra através da coluna cromatográfica até o detector. A diferença entra a CG e a cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR) é a coluna, pois enquanto na CGAR são utilizadas colunas capilares, nas quais a fase estacionária é um filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de maior diâmetro empacotadas com a fase estacionária.

Cromatografia gasosa

Fonte: site “Linde Gases Ltda.”

  

            Dentre as aplicações em análises, existem duas que dão base a todos os tipos de análises: a realização de separações, que possui excelente aplicação em sistemas bioquímicos, complexos organometálicos ou orgânicos, com espécies voláteis ou que possam reagir formando produtos voláteis. A segunda aplicação é a função de proporcionar os meios para que seja realizada uma análise completa.

          A cromatografia líquida clássica (CLC) é uma técnica muito usada para isolamento de produtos naturais e purificação de reações químicas. As fases estacionárias mais utilizadas são sílica e aluminia (fases estacionárias sólidas levam à separação por adsorção e fases líquidas por partição, suportes quimicamente modificados têm sido usados no processo de separação misto). A principal etapa nessa técnica é o empacotamento, que definirá a eficiência da separação (a alumina é empacotada em sua forma original, enquanto a sílica é empacotada na forma de suspensão). Adiciona-se uma pequena quantidade de solvente à coluna e deposita-se na sua extremidade inferior um chumaço de algodão para impedir a passagem de partículas da fase estacionária, adiciona-se a sílica com a torneira semi-aberta, o adsorvente é adicionado aos poucos à coluna fixada na posição vertical batendo-se continuamente ao longo da mesma para que todo ar seja expulso evitando a formação de canais na coluna que alargam as bandas eluídas.

Cromatografia líquida

Fonte: site “QNInt – Química Nova Interativa”

  

           Já a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ou HPCL (High Performance Liquid Chromatography), é uma técnica que em menos de trinta anos passou a ser um dos métodos mais utilizados, tanto para fins qualitativos quanto para fins quantitativos. É muito aplicada à separação de solutos de diferentes polaridade, massas molares e funcionalidades químicas. Essa técnica possui adaptabilidade para determinações quantitativas, com boa sensibilidade, possibilidade de separação de espécies não voláteis e termicamente instáveis; além disso, possui aplicação em determinações ambientais e em muitos outros campos da ciência. Dentro desta técnica, 90% dos laboratórios usam pelo menos um método que aplica a modalidade de CLAE em fase reversa (CLAE-FR), que possui uma fase estacionária de menor polaridade e uma fase móvel de maior polaridade, enquanto a fase normal tem as polaridades invertidas. Estas fase apresentam vantagens como o uso de fases móveis menos tóxicas e de menor custo, fases estacionárias estáveis de muitos tipos diferentes, rápido equilíbrio da coluna após a mudança da fase móvel, facilidade de empregar eluição por gradiente, maior rapidez em análises e boa reprodutibilidade dos tempos de retenção.

          As fases móveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso. A bomba deve proporcionar ao sistema vazão contínua sem pulsos com alta reprodutibilidade, as válvulas de injeção usadas possuem uma alça de amostragem para introdução da amostra. As colunas utilizadas são geralmente de aço inoxidável e o detector mais utilizado é o ultravioleta. O registro de dados pode ser feito através de um registrador, um integrador ou um microcomputador.

   Apesar do grande poder de solubilização dos fluidos supercríticos, o uso da cromatografia supercrítica (CSC) em química somente se verificou no final do século XX. Estes fluidos ainda têm sido extremamente modestos no Brasil, o que não é justificado se considerarmos o enorme potencial de aplicação dos mesmos em várias técnicas, destacando-se a cromatografia com fluido supercrítico (SFC – Supercritical Fluid Chromatography) e a extração com fluido supercrítico (SFE – Supercritical Fluid Extraction). Fluido supercrítico é toda substância que se encontrar em condições de pressão e temperatura superiores aos seus parâmetros críticos. Suas propriedades físico-químicas são intermediárias àquelas dos gases ou dos líquidos, se aproximando às melhores características de cada um.

Sua fase móvel é um fluido e a técnica é usada para utilizações específicas, apresentando vantagens na área entre a cromatografia gasosa e a líquida, tornando possível, por exemplo, a separação de substâncias não voláteis em colunas abertas. Utiliza-se como fase móvel um vapor pressurizado, em temperatura e pressão acima de seu ponto crítico, com as vantagens de ter viscosidade menor que um líquido, mas mantendo as propriedades de interação com os solutos.

      Na cromatografia de adsorção as separações ocorrem através de interações eletrostáticas entre a fase estacionária e os componentes a serem separados (fase móvel). O fracionamento por cromatografia de interação hidrofóbica em coluna é essencialmente determinado por diferenças de polaridade dos componentes na mistura. A cromatografia de partição é baseada nas diferenças de solubilidade dos componentes na fase estacionária e na fase móvel. Na cromatografia de permuta iônica, a separação ocorre devido tendências dos componentes iônicos ou ionizados permutarem com íons da fase móvel e o suporte pode ser controlado por alteração do pH e da força iônica do eluente. A cromatografia de exclusão molecular separa os componentes segundo o tamanho efetivo das moléculas (moléculas grandes não penetram no interior do suporte) e movem-se mais rapidamente através da coluna de onde emergem primeiro, enquanto as moléculas pequenas veem sua velocidade de deslocamento retardada por penetrarem no gel, emergindo da coluna mais tardiamente. Na cromatografia de afinidade ocorre ligação molecular específica e reversível entre soluto e ligante imobilizado na fase estacionária, sendo uma técnica utilizada especificamente para separação de produtos biológicos, como ligações de enzimas e substratos, anticorpos e substratos e receptores de hormônios.

          A cromatografia em papel é uma técnica de partição líquido-líquido, um deles fixado em suporte sólido imiscível (papel filtro), sendo bastante usada na separação de compostos polares por ser um método simples e de baixo custo. Nesta técnica, uma amostra líquida flui por uma tira de papel adsorvente disposto verticalmente. Conforme o solvente flui através do papel, uma partição deste composto ocorre entre a fase móvel orgânica e a fase estacionária aquosa, fazendo com que parte do soluto deixe o papel e entre na fase móvel. Com o fluxo contínuo de solvente, o efeito desta partição entre as fases móvel e estacionária possibilita a transferência do soluto do seu ponto de aplicação no papel, para um outro ponto localizado a alguma distância do local de aplicação no sentido do fluxo de solvente.

Já a cromatografia em camada delgada é uma técnica de separação líquido-sólido que se dá pelas diferenças de afinidade entre os componentes. É aplicada principalmente no acompanhamento de substâncias orgânicas, na purificação e substâncias e em sua identificação, além de ser usada para o controle analítico de matérias-primas. Depois que a amostra é aplicada sobre a placa, um solvente é permeado pela placa, fazendo com que os diferentes componentes percorram a placa de maneiras diferentes, permitindo a separação.

Quando a fase estacionária é mais polar que a móvel, a cromatografia é denominada cromatografia de fase normal. Já na situação inversa (fase estacionária apresenta menor polaridade que o solvente, a cromatografia recebe o nome de cromatografia de fase reversa. A técnica mais corrente é a cromatografia de eluição, onde o eluente flui através da coluna.