Cromatografia

A cromatografia é uma técnica quantitativa com finalidade de identificação e separação-purificação de misturas. Usa propriedades como solubilidade, tamanho e massa. O processo de separação de mistura passa por duas fases: fase estacionária (fixa, com material poroso como filtro) e fase móvel (com um líquido ou um gás), sendo que os constituintes da mistura interagem com as fases fazendo a separação (a mistura pode ser separada em várias partes ou ser purificada).

Foi originada a partir do termo grego chroma (cor) + graphein (escrever). Começou a ter maior importância em 1903, com o botânico Mikhail Semenovich Tswett, nascido em Asti (Itália), com família de origem russa. Mikhail desenvolveu diversos trabalhos na separação de extratos de plantas durante suas pesquisas sobre a clorofila, onde foi verificada a formação de bandas de cores diferentes nas colunas utilizadas, e mais tarde foi considerado a pai da cromatografia.

Apesar deste estudo, a técnica foi ignorada até ser redescoberta na década de 30. A partir daí, trabalhos na área e os avanços tecnológicos possibilitaram o aperfeiçoamento da técnica, levando-a a um elevado grau de sofisticação.

Essa técnica tem inúmeras aplicações, como a separação de componentes relativamente voláteis (álcoois, cetonas, aldeídos e outros), além da purificação de produtos farmacêuticos, proteínas, aminoácidos, ácidos nucleicos, vitaminas e esteróides.

Há várias maneiras de se medir a área de um pico cromatográfico, dentre elas estão as técnicas manuais (ocorre a coleta do cromato por um registrador analógico, onde a área dos picos é medida manualmente, usando-se o procedimento baseado na suposição do pico cromatográfico se assemelhar a um triângulo isóscele), integradores eletrônicos (dispositivos baseados em microprocessadores que, ao coletar o sinal cromatográfico, o digitalizam, detectam a presença de picos e calculam sua área, costumando ser muito mais precisos e rápidos do que qualquer método manual) e computadores (pode ser usado no lugar do integrador, desde que este contenha um dispositivo para converter o sinal elétrico em números que possam ser armazenados em memória, além da necessidade de disposição de programas para fazer análise do cromato digitalizado).

As fases móvel e estacionária são caracterizadas da seguinte forma: fase estacionária (fase fixa, onde a substância se fica na superfície de outro material) e fase móvel (fase onde as substâncias são “arrastadas” por um solvente fluido, podendo ser líquido ou gasoso).

A fase móvel apresenta três tipos de cromatografia: a cromatografia gasosa (CG), a cromatografia líquida e a cromatografia supercrítica (CSC, onde é usado um vapor pressurizado, acima de sua temperatura crítica). A cromatografia líquida ainda é subdividida em: cromatografia líquida clássica (CLC, onde a fase móvel é arrastada através da coluna apenas pela força da gravidade), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE, onde se utilizam fases estacionárias de partículas menores, sendo necessário o uso de uma bomba de alta pressão para eluição da fase móvel). Nas fases móveis gasosas, as separações podem ser obtidas por cromatografia gasosa (CG, onde são utilizadas colunas de maior diâmetro empacotadas com a fase estacionária) e por cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR, onde são utilizadas colunas capilares nas quais a fase estacionária é um filme depositado na mesma).

Já a fase estacionária, distingue-se entre fases estacionárias sólidas, líquidas e quimicamente ligadas. Em casos de fases estacionárias líquidas, este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte sólido ou imobilizado sobre ele, enquanto em fases quimicamente ligadas, suportes modificados são considerados separadamente por diferirem dos outros em seu mecanismo de separação.

Os constituintes básicos de um sistema cromatográfico são: reservatório de gás de arraste e controles de vazão/pressão, sistema de introdução de amostra (injetor/vaporizador), coluna cromatográfica e controle de temperatura da coluna (forno da coluna), detector, eletrônica de tratamento (amplificação) de sinal e registro de sinal (registrador ou computador).

No reservatório, o gás de arraste (os mais usados são H2, He e N2) fica contido em cilindros sob pressão e com vazão constante, dessa forma o gás não depende da amostra a ser separada, além disto, seu parâmetro mais importante é sua compatibilidade com o detector. A introdução da amostra é feita no injetor, que é um bloco de metal com um orifício contendo um septo, de borracha ou silicone, onde amostras líquidas ou gasosas podem ser injetadas; o mesmo deve estar aquecido a uma temperatura acima do ponto de ebulição dos componentes da amostra (temperaturas excessivamente altas podem decompor a amostra), para que haja volatilização da amostra e a mesma seja carregada para a coluna. Depois de injetada, a amostra é colocada na coluna cromatográfica, onde é feita a separação. A afinidade de um soluto é determinada pela volatilidade do soluto, pressão do vapor e temperatura. O detector quantifica e indica o que sai da coluna. A eletrônica de tratamentos purifica os ruídos para melhor análise, enquanto o registro de sinal analisa e avalia os dados obtidos no processo.

Cromatógrafo

 Fonte: site “PG HST”

        A cromatografia gasosa (CG) é usada para fins analíticos e permite a separação de substâncias voláteis arrastadas por um gás através de uma fase estacionária, sólida ou líquida, que propicia a distribuição dos componentes da mistura entre as duas fases através de processos fisioquímicos. Na fase móvel é usado o gás de arraste (dentre os mais usados estão o hidrogênio, azoto, hélio e árgon), que transporta a amostra através da coluna cromatográfica até o detector. A diferença entra a CG e a cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR) é a coluna, pois enquanto na CGAR são utilizadas colunas capilares, nas quais a fase estacionária é um filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de maior diâmetro empacotadas com a fase estacionária.

Cromatografia gasosa

Fonte: site “Linde Gases Ltda.”

  

            Dentre as aplicações em análises, existem duas que dão base a todos os tipos de análises: a realização de separações, que possui excelente aplicação em sistemas bioquímicos, complexos organometálicos ou orgânicos, com espécies voláteis ou que possam reagir formando produtos voláteis. A segunda aplicação é a função de proporcionar os meios para que seja realizada uma análise completa.

          A cromatografia líquida clássica (CLC) é uma técnica muito usada para isolamento de produtos naturais e purificação de reações químicas. As fases estacionárias mais utilizadas são sílica e aluminia (fases estacionárias sólidas levam à separação por adsorção e fases líquidas por partição, suportes quimicamente modificados têm sido usados no processo de separação misto). A principal etapa nessa técnica é o empacotamento, que definirá a eficiência da separação (a alumina é empacotada em sua forma original, enquanto a sílica é empacotada na forma de suspensão). Adiciona-se uma pequena quantidade de solvente à coluna e deposita-se na sua extremidade inferior um chumaço de algodão para impedir a passagem de partículas da fase estacionária, adiciona-se a sílica com a torneira semi-aberta, o adsorvente é adicionado aos poucos à coluna fixada na posição vertical batendo-se continuamente ao longo da mesma para que todo ar seja expulso evitando a formação de canais na coluna que alargam as bandas eluídas.

Cromatografia líquida

Fonte: site “QNInt – Química Nova Interativa”

  

           Já a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ou HPCL (High Performance Liquid Chromatography), é uma técnica que em menos de trinta anos passou a ser um dos métodos mais utilizados, tanto para fins qualitativos quanto para fins quantitativos. É muito aplicada à separação de solutos de diferentes polaridade, massas molares e funcionalidades químicas. Essa técnica possui adaptabilidade para determinações quantitativas, com boa sensibilidade, possibilidade de separação de espécies não voláteis e termicamente instáveis; além disso, possui aplicação em determinações ambientais e em muitos outros campos da ciência. Dentro desta técnica, 90% dos laboratórios usam pelo menos um método que aplica a modalidade de CLAE em fase reversa (CLAE-FR), que possui uma fase estacionária de menor polaridade e uma fase móvel de maior polaridade, enquanto a fase normal tem as polaridades invertidas. Estas fase apresentam vantagens como o uso de fases móveis menos tóxicas e de menor custo, fases estacionárias estáveis de muitos tipos diferentes, rápido equilíbrio da coluna após a mudança da fase móvel, facilidade de empregar eluição por gradiente, maior rapidez em análises e boa reprodutibilidade dos tempos de retenção.

          As fases móveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso. A bomba deve proporcionar ao sistema vazão contínua sem pulsos com alta reprodutibilidade, as válvulas de injeção usadas possuem uma alça de amostragem para introdução da amostra. As colunas utilizadas são geralmente de aço inoxidável e o detector mais utilizado é o ultravioleta. O registro de dados pode ser feito através de um registrador, um integrador ou um microcomputador.

   Apesar do grande poder de solubilização dos fluidos supercríticos, o uso da cromatografia supercrítica (CSC) em química somente se verificou no final do século XX. Estes fluidos ainda têm sido extremamente modestos no Brasil, o que não é justificado se considerarmos o enorme potencial de aplicação dos mesmos em várias técnicas, destacando-se a cromatografia com fluido supercrítico (SFC – Supercritical Fluid Chromatography) e a extração com fluido supercrítico (SFE – Supercritical Fluid Extraction). Fluido supercrítico é toda substância que se encontrar em condições de pressão e temperatura superiores aos seus parâmetros críticos. Suas propriedades físico-químicas são intermediárias àquelas dos gases ou dos líquidos, se aproximando às melhores características de cada um.

Sua fase móvel é um fluido e a técnica é usada para utilizações específicas, apresentando vantagens na área entre a cromatografia gasosa e a líquida, tornando possível, por exemplo, a separação de substâncias não voláteis em colunas abertas. Utiliza-se como fase móvel um vapor pressurizado, em temperatura e pressão acima de seu ponto crítico, com as vantagens de ter viscosidade menor que um líquido, mas mantendo as propriedades de interação com os solutos.

      Na cromatografia de adsorção as separações ocorrem através de interações eletrostáticas entre a fase estacionária e os componentes a serem separados (fase móvel). O fracionamento por cromatografia de interação hidrofóbica em coluna é essencialmente determinado por diferenças de polaridade dos componentes na mistura. A cromatografia de partição é baseada nas diferenças de solubilidade dos componentes na fase estacionária e na fase móvel. Na cromatografia de permuta iônica, a separação ocorre devido tendências dos componentes iônicos ou ionizados permutarem com íons da fase móvel e o suporte pode ser controlado por alteração do pH e da força iônica do eluente. A cromatografia de exclusão molecular separa os componentes segundo o tamanho efetivo das moléculas (moléculas grandes não penetram no interior do suporte) e movem-se mais rapidamente através da coluna de onde emergem primeiro, enquanto as moléculas pequenas veem sua velocidade de deslocamento retardada por penetrarem no gel, emergindo da coluna mais tardiamente. Na cromatografia de afinidade ocorre ligação molecular específica e reversível entre soluto e ligante imobilizado na fase estacionária, sendo uma técnica utilizada especificamente para separação de produtos biológicos, como ligações de enzimas e substratos, anticorpos e substratos e receptores de hormônios.

          A cromatografia em papel é uma técnica de partição líquido-líquido, um deles fixado em suporte sólido imiscível (papel filtro), sendo bastante usada na separação de compostos polares por ser um método simples e de baixo custo. Nesta técnica, uma amostra líquida flui por uma tira de papel adsorvente disposto verticalmente. Conforme o solvente flui através do papel, uma partição deste composto ocorre entre a fase móvel orgânica e a fase estacionária aquosa, fazendo com que parte do soluto deixe o papel e entre na fase móvel. Com o fluxo contínuo de solvente, o efeito desta partição entre as fases móvel e estacionária possibilita a transferência do soluto do seu ponto de aplicação no papel, para um outro ponto localizado a alguma distância do local de aplicação no sentido do fluxo de solvente.

Já a cromatografia em camada delgada é uma técnica de separação líquido-sólido que se dá pelas diferenças de afinidade entre os componentes. É aplicada principalmente no acompanhamento de substâncias orgânicas, na purificação e substâncias e em sua identificação, além de ser usada para o controle analítico de matérias-primas. Depois que a amostra é aplicada sobre a placa, um solvente é permeado pela placa, fazendo com que os diferentes componentes percorram a placa de maneiras diferentes, permitindo a separação.

Quando a fase estacionária é mais polar que a móvel, a cromatografia é denominada cromatografia de fase normal. Já na situação inversa (fase estacionária apresenta menor polaridade que o solvente, a cromatografia recebe o nome de cromatografia de fase reversa. A técnica mais corrente é a cromatografia de eluição, onde o eluente flui através da coluna.